A Busca pelos Biomarcadores da DD




A team at Duke University has used expression microarray to measure the expression levels of more than 14,000 genes collected from divers’ blood.


Biomarcadores
O desenvolvimento de novas formas de estudar as causas e graus de estresse vivenciados pelo corpo durante a descompressão irão beneficiar não apenas os mergulhadores, mas também os pilotos de grandes altitudes e astronautas. Um indicador sanguíneo de estresse descompressivo (ED) pode ser utilizado como marcador biológico, ou biomarcador, em estudos de descompressão em humanos, proporcionando uma ideia clara dos mecanismos moleculares envolvidos na DD. Um biomarcador relacionado com a DD poderia também ser usado como ponto inicial para o desenvolvimento de um teste diagnóstico de DD em tempo real.

O Centro para Biomarcadores em Imagens do Massachusetts General Hospital define biomarcadores como "parâmetros anatômicos, fisiológicos, bioquímicos ou moleculares associados à presença ou à gravidade de estados de uma doença específica". O National Institute of Health define biomarcadores como "uma característica que pode ser objetivamente medida e avaliada como um indicador de processos biológicos normais, processos patogênicos ou respostas farmacológicas a intervenções terapêuticas. " Biomarcadores moleculares são estruturas químicas ou moleculares que indicam doenças, lesões ou fatores de estresse no corpo. Os biomarcadores incluem desde moléculas únicas ou macromoléculas até uma assinatura complexa de alterações moleculares baseadas em uma patologia específica. Os biomarcadores podem ser úteis para o diagnóstico de condições clínicas, prevendo consequências ou riscos clínicos e proporcionando medidas objetivas de doenças ou processos de lesão existentes.

Estudos de pesquisa de mergulho investigaram uma seleção de possíveis biomarcadores de ED e DD. Durante décadas os pesquisadores observaram parâmetros bioquímicos do sangue (como níveis de enzima e produtos metabólicos) em estudos sobre descompressão; entretanto, as pesquisas não estabeleceram nenhuma correlação direta entre esses parâmetros e a incidência ou gravidade de DD.

Ainda assim, os pesquisadores continuam a investigar marcadores de outras condições médicas como candidatos. Por exemplo, o dímero D, que é um pequeno fragmento de proteína produzido pela degradação de coágulos sanguíneos e serve como um marcador de lesão cerebral, foi medido em níveis aumentados em mergulhadores com DD que exibiam déficits neurológicos. Foi demonstrado que o S100ß, outro marcador de lesão cerebral, aumenta em animais submetidos a uma rápida descompressão. Pesquisadores também descobriram que os níveis do peptídeo natriurético cerebral no plasma começam a aumentar em mergulhadores após uma hora embaixo da água a 10 metros de profundidade e permanecem elevados por quatro horas após eles voltarem à superfície.

Assim como em parâmetros bioquímicos do sangue, entretanto, nenhum marcador neurológico foi estabelecido como um marcador potencial de ED ou DD. Estudos anteriores também mostraram que a creatina fofosquinase, um indicador de dano tecidual em doenças e lesões, aumenta significativamente em indivíduos diagnosticados com DD e está correlacionada com a presença de bolhas arteriais. Infelizmente, nenhum desses candidatos foi estabelecido como um biomarcador confiável de ED ou DD.
Contexto
Para pesquisar candidatos a biomarcadores no sangue, minha equipe de pesquisa na Duke University utiliza uma técnica chamada de microarray para análise de expressão, que mede o nível de expressão de cada um dos genes presentes em nossas células. Os genes contêm as informações básicas necessárias para produzir moléculas chamadas de proteínas, que são os compostos básicos do nosso corpo. Os genes também regulam como e onde as diferentes proteínas são feitas e usadas em nosso corpo. Quando os tecidos do corpo são expostos a fatores estressantes (como calor, infecção, lesão ou bolhas de gás), certos genes serão expressos ("ligados") ou reprimidos ("desligados") para iniciar uma resposta àquele fator estressante, o que causa uma maior ou menor produção da proteína correspondente àquele gene.

A informação genética nas células passa de DNA para RNA para proteínas. A tecnologia de microarrays é capaz de medir a quantidade de RNA de cada gene em uma célula, e isso fornece informações sobre o nível de expressão relativo de cada gene em uma amostra de sangue ou tecido. Nós conduzimos uma pesquisa para investigar o nível de expressão relativa de todos os genes em células do sangue circulante para proporcionar um entendimento sobre candidatos a novos marcadores genéticos e vias moleculares envolvidas no ED.
Métodos
Usando microarray para análise de expressão nós medimos os níveis de expressão de mais de 14.000 genes de amostras de sangue venoso humano coletadas uma hora antes e duas horas após mergulhos experimentais. Os indivíduos estudados eram submergidos e faziam exercícios em uma câmara hiperbárica, o que permitiu a equipe de pesquisa controlar com precisão o perfil do mergulho experimental para minimizar potenciais fontes de variação. Nós comparamos amostras pré mergulho e pós mergulho para identificar genes importantes e as vias bioquímicas correspondentes na resposta ao ED. Nenhum dos indivíduos estudados apresentou sintomas de DD.


Um voluntário se prepara para começar a fazer exercícios embaixo da água em uma câmara hiperbárica.
Os indivíduos estudados respiravam oxigênio hiperbárico durante a descompressão. Como as alterações na expressão gênica após os mergulhos experimentais poderiam estar relacionadas a respirar altas pressões parciais de oxigênio, conduzimos um experimento separado para analisar a expressão gênica no sangue uma hora antes e duas horas depois de respirar oxigênio hiperbárico. Da mesma forma, como os indivíduos se exercitavam durante a fase de fundo do mergulho, nós avaliamos alterações na expressão gênica no sangue após exercícios de intensidade e duração semelhantes em um experimento separado.

Por último, consideramos o efeito da hora do dia na expressão gênica coletando amostras aproximadamente às 7 da manhã e 5 da tarde para a série de mergulhos experimentais. Coletamos sangue de um grupo separado sem nenhuma outra exposição experimental às 7 da manhã e 5 da tarde para nos ajudar a identificar aqueles genes que são expressos em diferentes níveis apenas baseado na hora do dia. Nós processamos as amostras de sangue para extrair o RNA das células e então processamos o RNA para medir os níveis de expressão relativa de mais de 14.000 genes utilizando a técnica de microarray para análise de expressão.
Resumo
Análises estatísticas revelaram que mais de 700 genes (de mais de 14.000 que foram medidos) eram expressos em níveis significantemente maiores ou menores após os mergulhos experimentais em comparação com medidas de referência pré mergulho.

Na análise do grupo controle de exposição hiperóxica, aproximadamente 200 genes eram expressos em comparação com níveis de referência, incluindo genes associados à comunicação celular e à adesão celular. As análises de amostras de sangue coletadas para considerar a hora do dia demonstraram aproximadamente 30 genes que eram expressos diferentemente entre 7 horas da manhã e 5 da tarde. Com relação ao efeito do exercício, não houve alterações importantes na expressão gênica duas horas após o exercício em comparação com os níveis de referência.

Após excluir os genes que eram ligados ou desligados devido à hora do dia ou exposição hiperóxica, o estudo ainda revelou aproximadamente 700 genes que eram expressos ou reprimidos em níveis significantes após exposições a mergulhos experimentais. Esses resultados demonstram que um número importante de genes do sangue periférico é regulado diferentemente em resposta ao mergulho — independente da exposição hiperóxica, exercício ou hora do dia. Um grande número desses genes está associado às respostas imune inatas e inflamatórias.
Impacto
Nesse estudo nós identificamos um grupo de genes chave e vias no nível gênico associados ao estresse descompressivo como um primeiro passo na identificação de potenciais candidatos a biomarcadores de ED e DD. Compreender o mecanismo de uma lesão, resposta ou processo de uma doença é útil, se não necessário, para identificar possíveis biomarcadores daquela condição específica.

Várias vias foram sugeridas como mecanismos subjacentes do ED e DD em humanos. Um aumento da atividade de coagulação e evidência de coagulação foram demonstrados em casos de DD e em mergulhadores assintomáticos após exposições hiperbáricas. Ativação de plaquetas também foi detectada após mergulhos autônomos assintomáticos. Estudos demonstraram um aumento de marcadores inflamatórios e imunes após mergulhos assintomáticos e em casos de DD.

Estudos anteriores de Bruce Cameron e colegas investigaram a expressão de genes imuno-inflamatórios específicos em mergulhadores militares após mergulhos profundos com ar. Semelhantemente aos resultados de nossos estudos, eles descobriram que alguns genes imuno-inflamatórios são expressos diferentemente após o mergulho. Um estudo de acompanhamento feito pelo mesmo grupo avaliou o sangue periférico coletado pré e pós mergulho para detectar diferenças significantes na expressão gênica após uma série de mergulhos com mistura de gases. Foi observada uma expressão diferencial de genes imuno-inflamatórios pós mergulho em todos os perfis.

Um estudo recente baseado em microarray feito por Ingrid Eftedal e colegas coletou amostras de sangue antes e imediatamente após o primeiro e último mergulhos de uma série de três dias de mergulhos diários em águas abertas com ar comprimido. Esses pesquisadores encontraram alterações significativas na expressão gênica em células imunes e inflamatórias após o mergulho. Genes antioxidantes também foram regulados para cima. Os autores concluíram que muitos mergulhos podem causar alterações persistentes em vias de controle de morte celular, inflamação e respostas imunes inatas.


Pesquisadores obtiveram amostras de sangue venoso de indivíduos voluntários uma hora antes e duas horas após mergulhos experimentais.


Jan Krog e colegas recentemente sugeriram que marcadores relacionados com o sistema imune seriam candidatos ideais a biomarcadores de ED. A conclusão deles foi baseada no aumento do número de células matadoras naturais (NK, do inglês natural killer) circulantes e no aumento da toxicidade das células NK que eles encontraram em mergulhadores militares após descompressões de mergulhos de saturação profundos. Embora a ativação dessas vias tenha sido demonstrada após exposições a descompressão ou desenvolvimento de DD, nenhum biomarcador de ED ou prognosticadores de DD foram estabelecidos.

Nosso estudo investigou as alterações na expressão de milhares de genes em amostras de sangue humano após exposições a mergulho controladas, e a metodologia do estudo apresentava grupos controle para outras potenciais fontes de variância biológica (hiperóxia, hora do dia e exercício). O desenvolvimento e a validação de um marcador de ED ou de painéis de marcadores é o primeiro passo na identificação de um teste para uso em estudos de descompressão em humanos. Esse tipo de teste também pode oferecer a base para um teste diagnóstico de DD que poderia ser usando na definição do tratamento.

Estudos em andamento estão investigando candidatos multigene, genes individuais e proteínas associadas relacionadas a essas vias como possíveis marcadores sanguíneos de ED. O desenvolvimento de uma melhor compreensão das vias associadas a exposições descompressivas irá não apenas estabelecer ótimos candidatos a marcadores diagnósticos de ED e DD, como também irá proporcionar uma visão sobre os mecanismos moleculares e no nível tecidual subjacentes à resposta do corpo a formação, presença e danos de bolhas e a outros fatores estressantes potenciais associados à descompressão.


© Alert Diver — 2º Trimestre 2015

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